用于構(gòu)建模擬人類帕金森病患者PINK1與DJ-1基因功能缺失突變導致疾病發(fā)生的成年獼猴帕金森病模型，對于帕金森病的病因、發(fā)病機制以及診斷標志物發(fā)掘具有重要的參考價值。

動物模型制備過程中的監(jiān)督管理、處置措施、微生物菌株檢測、對環(huán)境和生態(tài)影響的評估等由中國科學院昆明動物研究所實驗動物中心統(tǒng)一管理。建模過程中未見動物出現(xiàn)感染與毒性反應(yīng)等。

1基因編輯獼猴多巴胺能系統(tǒng)嚴重損傷并出現(xiàn)精細運動障礙

經(jīng)典PD癥狀評估之后，我們進行了藥理學驗證，通過經(jīng)典藥理旋轉(zhuǎn)范式評價PD相關(guān)的多巴胺功能缺陷。本實驗中，獼猴進行阿撲嗎啡（Apo，一種多巴胺D1受體激動劑）誘導的旋轉(zhuǎn)測試。在受損側(cè)紋狀體的突觸后多巴胺受體總是比健康側(cè)的突觸后多巴胺受體對Apo更敏感，這種不平衡將導致獼猴在接受Apo注射后轉(zhuǎn)向健康側(cè)。在病毒注射后，給予Apo之前，由于基因編輯對黑質(zhì)多巴胺能系統(tǒng)的損傷，獼猴緩慢發(fā)展為向損傷側(cè)旋轉(zhuǎn)的趨勢（圖1 A）。給予Apo后，旋轉(zhuǎn)方向轉(zhuǎn)為健康側(cè)（圖1 B）。表明基因編輯后獼猴腦中PD相關(guān)的多巴胺系統(tǒng)嚴重損傷。

PD患者另一個行為異常是精細運動障礙。我們通過訓練獼猴抓取食物進行測量。根據(jù)獼猴的利手偏好選擇損傷黑質(zhì)的哪一側(cè)：1號中年獼猴和1號老年獼猴都是100%的右利手，所以我們將PINK1和DJ-1的AAV9s-sgRNA-Cas9注射到它們左側(cè)黑質(zhì)。相反，2號中年獼猴和2號老年獼猴基本都是左利手，我們對其右側(cè)黑質(zhì)進行基因編輯。病毒注射后，4只獼猴中3只在食物抓取中改變了利手（圖1 C），它們無法使用以前的利手獲取食物，不得不使用非利手。只有1號老年獼猴保持其手的偏好，但是，其取食的潛伏期顯著增加（圖1 D），準確度沒有變化（圖1 E），表明這只獼猴精細運動障礙較輕。

圖1 阿撲嗎啡（Apo）誘導的旋轉(zhuǎn)測試和取食任務(wù)驗證偏側(cè)黑質(zhì)基因編輯獼猴模型的多巴胺功能障礙和精細運動技能損傷。（A）基因編輯后，獼猴向損傷側(cè)自發(fā)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)逐漸增多。（B）基因編輯后，Apo誘導獼猴向健康側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)逐漸增多。（C）1號老年獼猴除外，另外三只獼猴在注射病毒后改變了它們利手偏好。（D）基因編輯后，1號老年獼猴在取食任務(wù)中的潛伏期顯著增加。（E）1號老年獼猴在取食任務(wù)中的準確率與基線相比沒有顯著變化。（A-B）和（D-E）的數(shù)據(jù)是平均值±SEM。

總之，通過AAV介導的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)共同編輯成年獼猴偏側(cè)黑質(zhì)的PINK1和DJ-1基因可導致PD典型的運動癥狀并得到藥理學與精細運動能力測試驗證。

2 黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的病理驗證

首先需排除對照側(cè)病毒注射對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的影響。我們發(fā)現(xiàn)兩只基因編輯獼猴對照側(cè)的多巴胺能神經(jīng)元與我們以前的研究中的兩只年齡匹配的對照獼猴（沒有任何手術(shù)的正常對照）相比，無論是細胞形態(tài)還是細胞數(shù)量都沒有顯著差異，表明AAV9注射劑和AAV9-SaCas9-SgControl不會對SNs造成任何明顯的損傷。

其次，為了驗證細胞計數(shù)方法的可靠性，對于SNpc中多巴胺能神經(jīng)元的總數(shù)，我們采用Garcia等和Gundersen等使用的方法估算。結(jié)果表明，基因編輯獼猴對照側(cè)SNpc神經(jīng)元的平均總數(shù)約14800，與之前的報道一致（約14500），表明該計數(shù)方法是可靠的。黑質(zhì)PSer129αS聚集計數(shù)時，發(fā)現(xiàn)陽性染色信號則進行統(tǒng)計。

3 病毒轉(zhuǎn)染和基因編輯的結(jié)果驗證

我們通過EGFP陽性神經(jīng)元Paris水平來衡量PINK1/Parkin通路的功能。若PINK1功能缺失，其關(guān)鍵底物Paris/ZNF746的表達上升。結(jié)果顯示，與EGFP陰性神經(jīng)元相比，Paris/ZNF746的表達量在AAV9-CRISPR/Cas9基因編輯獼猴（2號中年獼猴）的SN區(qū)域顯著增加（圖2 AB）。不僅驗證了AAV成功轉(zhuǎn)染了神經(jīng)元，還導致了PINK1/Parkin通路功能缺失，即Paris上調(diào)，與人類PD腦病理一致。同時，我們檢測了DJ-1蛋白在EGFP陽性神經(jīng)元中的表達，并與基因編輯側(cè)SN附近的EGFP陰性神經(jīng)元進行了比較，發(fā)現(xiàn)DJ-1顯著下調(diào)（圖2 CD）。綜上，黑質(zhì)AAV介導的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)導致PINK1和DJ-1功能下調(diào)，可能共同誘發(fā)獼猴PD發(fā)生。

圖2 PINK1與DJ-1表達水平改變的免疫熒光圖像與定量。（A）EGFP陰性或EGFP陽性神經(jīng)元（NeuN+）中可見Paris（紅色）熒光強度信號。（B）EGFP陽性神經(jīng)元中Paris的熒光強度顯著增加（EGFP陰性神經(jīng)元：N=18；EGFP陽性神經(jīng)元：N=30，P<0.001），是PINK1功能下調(diào)的可靠標志物，已在PD患者中得到證實。（C）EGFP陰性或陽性神經(jīng)元（NeuN+）獲得的DJ-1（紅色）熒光強度信號。（D）EGFP陽性細胞中DJ-1的熒光強度顯著降低（EGFP陰性神經(jīng)元：N=24；EGFP陽性神經(jīng)元：N=24，P<0.001）。比例尺：白色：100 μm，黃色：20 μm。B和D的數(shù)據(jù)是平均值±SEM。

4 基因編輯對獼猴黑質(zhì)小膠質(zhì)細胞和星型膠質(zhì)細胞的影響

為了解析病毒注射引起膠質(zhì)細胞激活引發(fā)的炎癥是否導致PD發(fā)生，我們首先檢測了黑質(zhì)星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞是否被黑質(zhì)EGFP+區(qū)域的病毒轉(zhuǎn)染與激活（圖3 A）。與基因編輯的SN中EGFP-區(qū)域相比（圖3 B），我們發(fā)現(xiàn)GFAP+細胞和Iba1+細胞都未與EGFP信號共表達，表明膠質(zhì)細胞未被病毒轉(zhuǎn)染。此外，膠質(zhì)細胞沒有明顯的形態(tài)變化（圖3 AB）。計數(shù)表明，與EGFP-區(qū)相比，SN中EGFP+區(qū)GFAP+和Iba1+細胞數(shù)量均無顯著增加（圖3 CD），表明AAV9介導的基因編輯過程中膠質(zhì)細胞沒有增生。

圖3 基因編輯側(cè)黑質(zhì)膠質(zhì)細胞的免疫熒光圖像與定量。（A）基因編輯側(cè)SN區(qū)域，EGFP+陽性神經(jīng)元附近星形膠質(zhì)細胞（GFAP+細胞）和小膠質(zhì)細胞（Iba1+細胞）的免疫熒光染色圖像。（B）基因編輯側(cè)SN區(qū)域，未表達EGFP附近（對照），即EGFP-附近星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的免疫熒光染色圖像。

（C）基因編輯側(cè)SN區(qū)域，星形膠質(zhì)細胞（GFAP+細胞）數(shù)量沒有顯著增加（P=0.687）。（D）基因編輯側(cè)SN區(qū)域，小膠質(zhì)細胞（Iba1+細胞）數(shù)量也未見顯著增加（P=0.066）。比例尺：40 μm；C和D的數(shù)據(jù)是平均值±SEM。

1實驗動物和倫理

實驗方案和動物福利均獲得中國科學院昆明動物研究所倫理委員會的批準（IACUC No.15001）。獼猴單籠飼養(yǎng)，標準的明/暗周期，自由取食飲水并由獸醫(yī)照看。10只雄性成年獼猴參與PD建模。其中，4只用于初步研究，嘗試單獨編輯PINK1（n=2，90067，95301）或DJ-1基因（n=2，95075，97081）；另4只用于PINK1與DJ-1基因的共同編輯（n=4，070229，070209，94089，97093）；其余2只獼猴是年齡匹配的對照（n=2，99357，91097），用于比較TH免疫組化染色結(jié)果。

2病毒載體構(gòu)建和突變效率檢測

AAV9-SaCas9載體從Addgene（＃61593）獲得并在COS7細胞系進行突變檢測。我們構(gòu)建的sgRNA-PINK1-A、sgRNA-PINK1-B、sgRNA-DJ-1-A和sgRNA-DJ-1-B均在COS7細胞的PINK1與DJ-1蛋白編碼區(qū)引起錯義突變。

3 MRI指導的黑質(zhì)（substantia nigra, SN）精準定位和病毒注射

獼猴腦黑質(zhì)（SN）的準確定位（誤差<1 mm）是實現(xiàn)AVV基因編輯有效性的先決條件，需要通過精準注射AVV成功轉(zhuǎn)染大范圍的SN。獼猴肌注阿托品（0.5 mg/mL，1ml，i.m.，Handu，中國新鄭），10分鐘后肌注氯胺酮（1.0-1.5 ml，0.1 g/2 ml，i.m.，中國臺州中牟）麻醉獼猴，然后肌注戊巴比妥鈉（40 mg/mL，20 mg/kg，i.m.，F(xiàn)luka，德國）維持深度麻醉。

為了使AVV轉(zhuǎn)染范圍最大限度覆蓋獼猴SN，我們添加了兩個具有相同參數(shù)的注射平面，分別位于SN最大面積平面的前后，間隔2 mm。因此，SN注射共有三個平行的冠狀平面。病毒注射共設(shè)6個點，每個注射點間隔1 mm（每條路徑總劑量50 μL）。同一SN的相鄰兩條路徑注射以相同的方式進行。三個平行注射路徑共150 μL的病毒，獼猴的對側(cè)黑質(zhì)為對照，注射不含基因編輯元件的AAV。我們通過注射泵（World Precision Instruments，Inc.，UMP 3-4，USA）維持病毒注射速度為800 nL/min。之后，縫合傷口。獼猴每天肌注80萬單位青霉素防止感染，持續(xù)一周。

4行為數(shù)據(jù)的收集和分析

1）我們通過數(shù)碼相機（Sony HDR-XR260，日本）收集每只獼猴行為的錄像。在上午10：00-11：00，位于籠子前方1米處的照相機在沒有外部干擾的情況下記錄單籠獼猴行為1小時。實驗期共收集日常行為數(shù)據(jù)七次，分別在第0周（基線），術(shù)后第6、10、12、14、16和18周的每周三上午進行。

2）為了檢測基因編輯對黑質(zhì)-紋狀體多巴胺功能的影響，我們采用Apo誘導的旋轉(zhuǎn)進行評估。首先，在1小時的視頻中，從第15分鐘到第45分鐘的30分鐘內(nèi)，對每只獼猴的自發(fā)旋轉(zhuǎn)計數(shù)。其次，獼猴注射Apo 10分鐘后，拍攝一段新的1小時視頻。同樣從第15分鐘到第45分鐘的30分鐘進行旋轉(zhuǎn)計數(shù)。在肌肉注射前5分鐘，將2 mg的Apo溶解于2 mL（1 mg/mL）的維生素C溶液（0.5 mg/2 mL）。在第0周（基線）、術(shù)后第6周、第10周、第12周、第14周的每周三日常行為錄像后分別進行5次旋轉(zhuǎn)行為測試。

3）為了研究獼猴在PD發(fā)展過程中的精細運動障礙，我們進行了食物抓取測試。獼猴需要從籠子前面的食物盒內(nèi)拿一塊食物作為獎勵。抓取行為穩(wěn)定后，收集基線數(shù)據(jù)，記錄抓取食物的潛伏期、正確率和利手偏好。每只獼猴須在每個測試周的三天內(nèi)完成180次測試（每天60次）。獼猴分別于第0周（基線）、術(shù)后第6周、第10周、第12周、第14周測試五次。

5 PD病理特征染色

1）TH染色：獼猴雙側(cè)SN的冠狀切片用3% H2O2（5 min）、3% triton X-100（4 min，中國北京索萊寶）和羊血清（15 min，中國福州邁新）處理，兔抗TH抗體（1:1000，AB152，Millipore）4 °C過夜。次日，將切片與二抗（PV-9000，30 min，中國北京中杉金橋）37 °C孵育。之后，切片DAB顯色2 min（DAB-1031Kit，20×，中國福州邁新），蘇木精復染細胞核。

2）PSer129αS染色：切片用10 μM/ mL蛋白酶K（中國上海阿拉?。┰?0 mM Tris-HCl，pH=7.8、100 mM NaCl，0.1％Tween-20（Bio-Rad，美國）37°C處理30 min。之后切片用3％H2O2（5 min，中國福州邁新）、3％Triton X-100（4 min，中國北京索萊寶），10％羊血清處理（15 min，中國福州邁新），經(jīng)典的兔抗PSer129αS多克隆抗體（1：100，ab59264，Abcam，美國）4°C過夜。次日切片與抗兔/小鼠二抗試劑盒（PV 9000，中國北京中杉金橋）37°C孵育30 min。之后，切片DAB顯色2 min（DAB-1031Kit，20×，中國福州邁新），蘇木精復染細胞核。

染色后，所有切片用乙醇梯度脫水并用二甲苯透明。中性樹脂封片，光學顯微鏡（奧林匹斯，CX41；照相機：奧林匹斯DP25；軟件：cellSens Entry 1.4.1；日本）采集照片。因大多數(shù)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元位于黑質(zhì)致密部，我們在4×物鏡（3.5 mm × 2.6 mm）、20×物鏡（690.8 μm × 518.1 μm）和40×物鏡（345.4 μm × 259 μm）下鑒定典型的細胞形態(tài)并以第三對腦神經(jīng)3n為參考，選定黑質(zhì)長軸近中心區(qū)域用于細胞計數(shù)。

通過ImageJ軟件（National Institutes of Health，Bethesda，Maryland，USA）在40×物鏡下對計數(shù)區(qū)域的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元（TH陽性染色細胞）計數(shù)，分別獲得獼猴對照側(cè)和基因編輯側(cè)的平均細胞密度（個數(shù)/mm2），進行統(tǒng)計。

6基因編輯效果驗證的共聚焦成像和數(shù)據(jù)量化

通過Nikon A1共聚焦顯微鏡獲取z-stack圖像。分析EGFP+NeuN+和EGFP-NeuN+黑質(zhì)細胞的Paris的熒光強度用于定量PINK1的表達水平，以及分析EGFP+NeuN+和EGFP-NeuN+黑質(zhì)細胞DJ-1的熒光強度，量化DJ-1的表達水平。