該模型的鑒與評價(jià)技術(shù)方法和指標(biāo)體系包括（1）分子水平：模型鼠基因型及mRNA表達(dá)應(yīng)符合5.1和5.2中指標(biāo)要求。（2）細(xì)胞水平：該基因過表達(dá)對細(xì)胞增殖影響應(yīng)符合5.3中指標(biāo)要求。（3）整體水平：模型小鼠造血干細(xì)胞對TBI和競爭性移植的影響應(yīng)符合5.4、5.5中指標(biāo)要求。。

在病毒感染引起的先天性免疫應(yīng)答，IFITM家族在其中起重要作用，但是關(guān)于該家族在其他方面的研究相對較少。通過前期的大數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)IFIMT6可能在造血干細(xì)胞的發(fā)育分化、衰老過程中發(fā)揮作用，為探明該基因在造血干細(xì)胞中的作用和機(jī)制，我們建立了該基因的敲除小鼠模型，通過初步研究發(fā)現(xiàn)該基因缺失，在正常情況下，分析造血干細(xì)胞分化發(fā)育的各譜系細(xì)胞，并未發(fā)現(xiàn)明顯差異，但是在TBI引起的造血干細(xì)胞損傷中起保護(hù)作用，并且通過競爭性移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該基因缺失，能夠增強(qiáng)其競爭性能力，表明該基因缺失可能在外界刺激的情況下起保護(hù)作用，但是具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

該基因敲除小鼠模型的建立，為該基因功能研究、病毒引起的先天性免疫應(yīng)答研究、造血干細(xì)胞的功能研究等提供動物模型支撐。

模型制作及動物實(shí)驗(yàn)中涉及動物的操作程序已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為ZLF18004。本實(shí)驗(yàn)部分使用了基因修飾動物（基因敲除），只在規(guī)定的SPF級動物設(shè)施內(nèi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)過程有防逃逸的措施，如擋鼠板等。動物在離開動物設(shè)施后，進(jìn)行完相關(guān)試驗(yàn)后，立即進(jìn)行處死，取材。動物尸體暫存于-20℃冰箱中，經(jīng)有資質(zhì)的公司運(yùn)走統(tǒng)一處理。

4.1 IFITM6主要定位于細(xì)胞膜上 構(gòu)建過表達(dá)IFITM6-Flag質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過用抗Flag抗體進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果表明IFITM6主要定位于細(xì)胞膜上（圖3A）。并對K562細(xì)胞中家族其他基因分析，發(fā)現(xiàn)IFITM1和IFITM2表達(dá)相對較高（圖3B），IFITM6過表達(dá)影響細(xì)胞增殖（圖3C）

圖3所示 在K562細(xì)胞中過表達(dá)影響細(xì)胞增殖

4.2 IFITM6敲除小鼠的建立

利用CRISPR/Cas9在IFITM6基因第二外線子選擇gRNA靶點(diǎn)，敲除第二外顯子。出生的小鼠經(jīng)過設(shè)計(jì)包含靶點(diǎn)的引物（Table1），進(jìn)行基因型鑒定，并進(jìn)行插入序列的測序，最終獲得了敲除第二外顯子的小鼠，如圖3-a所示。隨后，我們通過雜合子雜交的方式獲得了純合敲除小鼠，并進(jìn)行了表達(dá)分析，圖3-c顯示。結(jié)果表明我們成功建立了該基因的敲除小鼠模型。

圖3 IFITM6敲除小鼠的建立

Table 1 本文中用于基因型鑒定的引物信息

4.3 IFITM6敲除對家族其他成員的影響

我們分析了IFITM6敲除對家族其他成員的影響，結(jié)果表明IFIMT6敲除小鼠中，IFITM1表達(dá)升高，IFITM2和IFITM5表達(dá)下降，IFITM3表達(dá)變化不明顯（圖4所示）。

圖4 IFIMT6敲除對IFIMT家族其他成員表達(dá)的影響

4.4 IFITM6敲除影響LT-HSC

我們對該基因的敲除小鼠進(jìn)行了造血干細(xì)胞分化、發(fā)育相關(guān)的流式分析，結(jié)果表明基因缺失對LSK影響不明顯，但對LT-HSC有促進(jìn)作用，但是LT單克隆培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲除后會造成克隆形成數(shù)減少，但不影響克隆大小和形態(tài)（圖5所示）。

圖5 IFITM6敲除影響HSC功能

4.5 IFITM6敲除在輻射引起的損傷（TBI）中起保護(hù)作用

我們對該基因敲除小鼠進(jìn)行了輻射引起的損傷（TBI）實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示IFITM6敲除在TBI實(shí)驗(yàn)中起保護(hù)作用，并且克隆形成能力明顯增加（圖5所示）。

圖6 IFITM6敲除在TBI實(shí)驗(yàn)中起保護(hù)作用

4.6 IFITM6敲除影響骨髓競爭性移植

我們通過競爭性移植實(shí)驗(yàn)，初步分析發(fā)現(xiàn)，IFITM6敲除在競爭性移植中起保護(hù)作用（圖7所示）。由于動物目前數(shù)量較少，需要進(jìn)一步增加動物數(shù)量進(jìn)一步核實(shí)。

圖7 競爭性移植實(shí)驗(yàn)

5.1基因型鑒定

該模型鼠是通過CRISPR技術(shù)，將IFITM6的第二外顯子敲除，，因此，在基因水平鑒定，需要區(qū)分野生型、雜合子和純合子，鑒定引物為Table1中所列。

5.2基因表達(dá)情況

對敲除鼠組織取材，通過Q-PCR檢測檢測不到IFITM6基因的表達(dá)。

5.3 過表達(dá)K562細(xì)胞增殖的影響

該基因的表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜上，過表達(dá)會影響K562細(xì)胞的增殖。

5.4 在TBI中的作用

該基因敲除在TBI引起的造血干細(xì)胞損傷過程中起保護(hù)作用。

5.5 該基因敲除對競爭性移植的影響

該基因敲除后，通過競爭性移植實(shí)驗(yàn)，敲除細(xì)胞在受體鼠中占具數(shù)量優(yōu)勢。

3.1 實(shí)驗(yàn)材料

3.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

C57BL/6購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司 SCXK(京）2016-0006。超排用雌鼠數(shù)量10-15只，年齡3周齡，交配傳代用野生型鼠為成年8-10周齡小鼠。實(shí)驗(yàn)中基因工程小鼠由本實(shí)驗(yàn)室繁殖產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)中涉及動物的操作程序已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為ZLF18004.

3.1.2實(shí)驗(yàn)儀器

3.1.3實(shí)驗(yàn)試劑

3.1.4 模型構(gòu)建流程 利用CRISPR/Cas9技術(shù)制備IFITM6敲除小鼠。選擇敲除第二外顯子，來構(gòu)建IFITM6敲除小鼠 (B6. IFITM6 (tm)-GC/ILAS)。該基因敲除的雜合子小鼠，相互雜交可以獲得該基因敲除的純合子小鼠，使用PCR方法進(jìn)行基因型鑒定。3.1.5 IFITM6敲除小鼠的建立3.1.5.1 IFITM6敲除小鼠模型的建立(1) 設(shè)計(jì)方案

(2) 構(gòu)建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expressionvector，根據(jù)基因信息選擇靶點(diǎn)并合成sgRNA。

靶點(diǎn)1:

M-Ifitm6-EA1-g-up: TAGGACTGGGATCTGGTATAGG

M-Ifitm6–EA1-g-down: AAACCCTATACCAGATCCCAGT

靶點(diǎn)2:

M-Ifitm6-EB1-g-up: TAGGGAGAATGCCCAGGGATTC

M-Ifitm6–EB1-g-down: AAACGAATCCCTGGGCATTCTC合成的sgRNA單鏈通過退火復(fù)性結(jié)合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構(gòu)建完成的sgRNA載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的sgRNA。

(3) 構(gòu)建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的Cas9-RNA。

(4) 顯微注射

1) 超數(shù)排卵：10-15只3周齡雌鼠注射激素進(jìn)行超排。

2) 受精卵注射：取約120枚受精卵進(jìn)行注射。

3) 受體鼠制備：8-10周齡雌鼠與結(jié)扎的SD雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。

4) 胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，120枚卵，5只受體鼠）。

(5) 基因型鑒定

1) 剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進(jìn)行編號及取材。

2) 基因組DNA提?。菏褂没蚪MDNA提取試劑盒提取基因組DNA

3) PCR檢測：根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)檢測引物并進(jìn)行PCR檢測。

(6) 結(jié)果分析：選取通過PCR檢測后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，之后用檢測引物進(jìn)行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。

(7) 根據(jù)測序結(jié)果確定IFITM6敲除小鼠模型(B6.IFITM6 (tm)-GC/ILAS)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.1.5.2 動物繁殖和表達(dá)圖譜分析

獲得F0代后，首先通過與野生型鼠進(jìn)行雜交，進(jìn)行基因修飾鼠傳代能力分析。獲得能夠傳代的雜合子小鼠進(jìn)行相互雜交，產(chǎn)生純合敲除小鼠并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖 2. IFITM6敲除小鼠的繁育

3.1.5.3 鼠尾基因組DNA提取

在幼崽出生后剪腳趾標(biāo)記，收集幼崽腳趾至1.5 mL EP管。然后參照DNA提取試劑盒（全式金）說明書按以下程序操作。

(1) 加入100μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃搖床孵育至完全裂解。

(2) 12000rpm 離心5min，轉(zhuǎn)移上清于一無菌的離心管中。

(3) 加入500μLBB2，立即渦旋5s，室溫孵育10min。

(4) 將全部的溶液加入離心柱中，8000rpm離心1min，棄掉流出液。

(5) 加入500μL CB2溶液，12000 rpm離心1min，棄掉流出液。

(6) 重復(fù)步驟（5）一次。

(7) 加入500μL WB2（使用前加入88 mL無水乙醇），12000rpm 離心1min，棄掉流出液。

(8) 重復(fù)步驟（7）一次。

(9) 10000rpm 離心2min，徹底去除殘留的WB2。

(10) 將離心柱置于一干凈的離心管中，開蓋靜置5min，在柱的中央加入50~200μL預(yù)熱EB（60℃~70℃），蓋上蓋子，室溫靜置3min，12000rpm 離心2min，洗脫DNA。保存至4℃冰箱。

一、疾病概述

固有免疫是機(jī)體防御外來病毒感染的第一道防線，通過識別病原并產(chǎn)生各種細(xì)胞因子、趨化因子、干擾素（IFN）等多種抗病毒因子。干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白（IFITM家族），是一類具有抗病毒作用的ISG（干擾素誘導(dǎo)基因）的編碼產(chǎn)物，并證明其在多種生物過程中發(fā)揮作用，具有廣泛的抗病毒作用，并在免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞歸巢等發(fā)揮作用。

IFITM家族包括IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5、IFITM6、IFITM7和IFITM10，除了IFITM5特異性表達(dá)與骨細(xì)胞，不依賴與IFN的表達(dá)，其余家族在IFN的調(diào)控下在多組織和器官廣泛表達(dá)。其中，F(xiàn)ITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM10在人類中表達(dá)，F(xiàn)ITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM6在小鼠中表達(dá)（圖1）。

圖1 IFITM家族成員 （a）人和小鼠的IFITM家族成員差異比較（b）IFITM家族的跨膜形式。

IFITM家族具有兩個(gè)輸水區(qū)，被一個(gè)稱為保守型細(xì)胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)（CTL）保守區(qū)分開。IFITM在不同組織和細(xì)胞中，分布相對廣泛。IFITM1主要位于細(xì)胞膜和早期內(nèi)體，能夠與細(xì)胞表面分子CD19和CD81相互作用。報(bào)道顯示CD81是HCV的受體，表明IFITM1可能與HCV感染進(jìn)入細(xì)胞存在相關(guān)性。IFITM2和IFITM3主要存在于晚期內(nèi)體和溶酶體，并于Ras相關(guān)蛋白RAB7、CD63和LAMP1共定位。通過功能基因組篩選，發(fā)現(xiàn)IFIMT1、IFIMT2、 IFIMT3，能夠被1型和2型IFN誘導(dǎo)表達(dá)，并對于IFN抑制流感性病毒發(fā)揮重要作用。IFITM3基因敲除小鼠模型，在感染流感病毒后引起爆發(fā)性病毒肺炎，重新基于IFIMI3可以逆轉(zhuǎn)病情。已有的研究還表明IFIMT家族還參與Th1和Th2細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)（圖2所示）。IFIMT5參與成骨細(xì)胞和礦物鹽沉積。IFITM10在不同物種中的同源非常高，高達(dá)85%以上，但是功能仍是未知。通過敲除小鼠的IFITM3, IFITM5，和IFITM 6基因后，發(fā)現(xiàn)能夠影響Th1細(xì)胞的分化，但是IFITM6的具體功能仍不清楚。

圖2 IFTIM家族參與Th1和Th2的分化調(diào)節(jié)

IFITM作為固有免疫系統(tǒng)IFN效應(yīng)的重要元件，在病毒性疾病的防御過程中發(fā)揮重要作用。由于IFITM參與調(diào)節(jié)機(jī)體的固有免疫，在病毒引起的疾病機(jī)制中具有重要作用。IFITM敲除的小鼠在Th2設(shè)計(jì)的免疫病理和應(yīng)答中起保護(hù)作用。IFITM家族作為抗病毒治療的有效靶點(diǎn)，能夠抑制病毒入胞和復(fù)制，這對病毒感染相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供可能的新的藥物靶點(diǎn)。

1、基因信息

干擾素誘導(dǎo)膜蛋白6（interferon induced transmembrane protein 6 ，Ifitm6，GENE ID：213002），由IFITM6基因所編碼，功能不明確，可能在Th2細(xì)胞的分化過程中起作用。

細(xì)胞：K562細(xì)胞（人類紅白血病細(xì)胞系），源自一個(gè)53歲的女性慢性髓性白血病爆發(fā)期病人的淋巴母細(xì)胞。293T細(xì)胞，人腎上皮細(xì)胞系，同時(shí)表達(dá) SV40 大 T 抗原。

2、實(shí)驗(yàn)動物背景信息

實(shí)驗(yàn)所用小鼠（C57BL/6）背景。C57BL/6小鼠也被稱為C57 black6，也稱作B6。1921年被培育出來，屬于近交品系。該品系的最主要的兩個(gè)特點(diǎn)就是品系穩(wěn)定和易于繁殖。主要用途包括：作為生理學(xué)與病理學(xué)的實(shí)驗(yàn)動物模型、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型、作為產(chǎn)生自發(fā)突變和誘發(fā)突變的同基因型小鼠的背景品系。該品系在國內(nèi)使用頻率高，價(jià)格相對便宜。

3、研究背景

在固有免疫系統(tǒng)中，IFITM作為固有免疫系統(tǒng)IFN效應(yīng)的重要元件，在病毒性疾病的防御過程中發(fā)揮重要作用。除在固有免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用，IFITM家族還參與其他生理功能，如IFIMT5參與成骨細(xì)胞和礦物鹽沉積。我們在前期工作中，通過造血干細(xì)胞的高通量測序和表達(dá)分析，篩選到基因IFITM6，表明該基因可能在造血干細(xì)胞的相關(guān)的生物學(xué)功能中發(fā)揮作用。IFITM6在小鼠造血干細(xì)胞中是否發(fā)揮作用，以及擁有怎樣的生物學(xué)功能，需要進(jìn)一步研究進(jìn)行闡述。

目前尚沒有IFITM6的基因敲除小鼠，構(gòu)建該基因的敲除小鼠，分析該基因敲除后的表型以及在造血干細(xì)胞中的功能，該項(xiàng)目不僅為該基因在造血干細(xì)胞中的功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也為該基因在病毒感染的先天性免疫機(jī)制研究中提供動物模型。

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